Arbetsflödet inom HPA

Mål och status

Det övergripande målet för Human Protein Atlas projektet är att genom antikropps-baserad proteomik kartlägga proteinuttrycket från människans runt 20.000 protein-kodande gener i en stor mängd normalvävnader, cancerformer och cell-typer. Strategin för att uppnå målet är att i stor skala framställa och validera antikroppar mot minst en isoform av varje proteinkodande gen och att använda dessa antikroppar i en mängd applikationer, bl.a. för immunohistokemisk färgning av mänskliga vävnader och cancrar, immunofluorescens på cell-linjer och Western blots. Denna kartläggning av det mänskliga proteomet kan ses som en naturlig fortsättning på kartläggningen av det mänskliga genomet och projektet baseras i mycket hög grad på den information som vi redan har om människans gensekvens.

The Human Protein Atlas-projektet initierades 2003 genom finansiering av Knut och Alice Wallenbergs stiftelse och den första on-line versionen av Atlasen gjordes publikt tillgänglig 2005. Den innehöll då data från strax över 700 antikroppar. I den senaste versionen av The Human protein Atlas (v.13, släppt i november 2014) har proteinuttrycket från nära 17.000 mänskliga gener analyserats med över 24.000 antikroppar, vilket motsvarar 84% av det mänskliga protein-kodande genomet.

Antigen och antikroppar

Antikroppstillverkningen börjar med att för varje gen identifiera en 50-150 aminosyror lång protein-kodande sekvens som är så unik som möjligt med avseende på alla andra protein-kodande sekvenser i genomet. Denna region kallas för en PrEST (Protein Eptoipe Signature Tag) och den klonas med sedvanliga molekylära metoder (primer design, cDNA bibliotek, RT-PCR, ligering, transformation, etc.) in i bakterier som tillverkar den rekombinanta PrEST-peptiden. PrESTen används sedan som i) antigen i immuniseringar, ii) för att bygga sk. PrEST-arrayer (se nedan) och iii) för affinitetsrening för att generera sk. mono-specifika antikroppar (msAb).

Efter immunisering processas det polyklonala antiserat för att eliminera oönskade och/eller ospecifika antikroppar genom affinitetsrening med PrESTen som bete. De antikroppar som bundits till PrESTen tas tillvara och används i vidare applikationer. De affinitetsrenade msAb testas först på en PrEST-array, där 384 olika PrESTar har spottats i ett microarray format, och antiserats specificitet och förmåga att känna igen sin motsvarande PrEST bland de övriga PrESTarna undersöks. Antikroppar som godkänns går därefter vidare till Western blot analys och immunohistokemisk testfärgning på vävnader. Godkända antikroppar går efter testfärgningen sedan vidare till storskalig proteinprofilering (skarpfärgning) och annotering.

Schematisk figur av PrEST produktion, från
bioinformatisk design, via kloning till proteinfabrik.

Proteinprofilering i vävnader och celler

Alla antikroppar som godkänts för proteinprofilering färgas på en serie bestående 9 olika tissue microarrays (TMAs) som innehåller sammanlagt 48 olika normalvävnader (i triplikat), 20 olika former av cancer (i duplikat, vanligen 12 patienter per cancer), 47 olika mänskliga cell-linjer och 12 stycken leukemier. För varje antikropp färgas totalt 708 olika prov som därefter skannas in som högupplösta digitala bilder.

Cell-linjernas bilder annoteras digitalt genom ett bildanalysprogram, medan vävnadsbilderna annoteras manuellt av certifierade patologer. Efter annoteringen utvärderas resultatet och antikroppen får en trovärdighets-rankning (reliability score) baserat på hur väl det observerade uttrycksmönstret stämmer med tidigare kända data för det aktuella proteinet. Därefter publiceras alla bilder tillsammans med annoteringsdata och antikroppsinformation i den nästföljande versionen av The Human Protein Atlas.

Parallellt med den immunohistokemiska analysen på celler och vävnader utförs även en analys av antikroppens subcellulära inbindningsmönster med hjälp av immunofluorecens och konfokalmikroskop på ett flertal cell-linjer. Den subcellulära lokalisationen annoteras manuellt och datat och bilderna publiceras tillsammans med det övriga datat från antikroppen.

Tissue microarray som parafinblock och
som Hematoxylin-Eosin färgat snitt

Hemsidan

Allt data görs tillgängligt gratis och publikt på The Human protein Atlas hemsida, som för närvarande uppdateras med nya data ca 1 gång per år. För att använda hemsidan och hitta det man leta efter krävs en sökning. Man kan antingen skriva in namnet på det protein man är intresserad av (enkel sökning) eller så kan man på ett intuitivt sätt bygga avancerade sökningar och fritt välja att inkludera eller exkludera uttryck bland vävnader, celltyper, cell-linjer, proteinklasser, subcellulär lokalisation, med mera.

Hemsidan är uppbyggd kring varje proteins sammanfattnings-sida, som ger en samlad bild av hur proteinet uttrycks i stor skala. Från sammanfattnings-sidan kan man sedan gå djupare ner i de specifika uttrycksmönstren i vävnader, cancrar och celler, samt navigera bland de bilder som ligger till grund för annoteringen som om man arbetade i ett mikroskop.